研究进展｜评估非洲猪瘟诊断技术：如何改进监测和控制计划

weiopop

摘要

该研究代表了欧盟（EU）中使用最广泛的非洲猪瘟（ASF）诊断技术的完整比较分析。

该研究使用的样本来自感染了欧洲流行的ASF 病毒（ASFV）基因II型分离株的田间和实验动物。

本研究使用785个田间和实验样本并行评估了三种不同的PCR检测ASFV的效果。结果表明， 通用探针库（UPL-PCR）与 real-time PCR (κ = 0.94 [95% CI, 0.91- 0.97]) 和OIE规定的常规PCR（K = 0.88 [95％ CI，0.83-0.92]）之间几乎完全一致。UPL-PCR对幸存者具有较高的诊断敏感性，且可以更早发现疾病。其与商业抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）相比，获得了良好至中等的一致性（κ= 0.67 [95％CI，0.58至0.76]），在商业测试中灵敏度为77.2％。

ASF抗体检测方面，本研究测试了五种血清学方法，包括三种商业ELISA，OIE-ELISA和验证性免疫过氧化物酶试验(IPT)。因为当仅存在很少的抗体时，IPT能够在血清学反应的早期检测到ASF抗体，所以IPT比ELISAs具有更高的敏感性。对野猪尸体渗出组织的分析表明，无论是否存在抗体，IPT都可能是一种有用的血清学工具，可以用于确定动物是否受到病毒感染。

综上所述，UPL-PCR与IPT结合使用是2014年欧盟国家发生疫情时检测ASF最可靠的方法。

在实施有效的控制程序时，使用最适当的诊断工具是至关重要的。

文章信息如上，本文仅代表作者观点

非洲猪瘟（ASF）是一种猪的复杂致命的病毒性疾病，它对国家，区域和国际贸易产生了重大负面影响，并限制了受影响地区的养猪生产。非洲猪瘟病毒（ASFV）是该疾病的致病因子，非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是一个较大的双链DNA病毒。

目前还没有预防ASF感染的疫苗。所适用的控制和根除措施均基于经典的疾病控制方法，包括监测、流行病学调查、追踪猪只和清除受感染的猪舍内的猪只。这些措施必须与养猪场内和运输生猪中严格的检疫和生物安全措施相结合。由于该疾病的特点，基于临床症状调查和猪高死亡率的被动监测在ASF的早期诊断中起着至关重要的作用。此外，鉴于一定比例的动物也可能在感染后存活，主动监测也为疾病的演变提供了非常有价值的数据，并对评价控制措施的有效性提供了指导。然而，要想取得成功，监测必须有足够的实验室支持，以便迅速诊断，才可能早期检测出ASF及弄清其如何传播。

ASF的诊断需要对已经感染或曾经感染过ASFV的猪进行鉴别，包括检测和鉴定ASFV特异性抗原、DNA和抗体。

OIE推荐的病毒检测试验包括病毒分离、荧光抗体试验(FAT)以及实时（ real-time）和常规PCR检测。

这些PCR技术是欧盟的国家参考实验室（NRL）最广泛使用的。近年来开发的新型实时PCR已被证明对检测感染后存活下来的动物具有更高的敏感性。

其他检测方法，如可对样本进行大规模检测的抗原检测酶联免疫吸附试验(ELISA)，也可在NRL水平上使用，但据报道，其分析灵敏度低于PCR检测。

ASF抗体的检测方面，OIE规定的检测方法包括使用ELISA进行抗体筛选，并以免疫印迹(IB)或间接免疫荧光(IIF)作为验证性检测。间接免疫过氧化物酶试验(IPT)经欧盟非洲猪瘟参考实验室(EURL)验证，具有有效的分析和诊断敏感性，可用于猪血清诊断ASF的替代验证性试验。此外，它可以方便地地应用于大量样品，并且不需要昂贵的荧光显微镜设备。

目前，有三种商业ELISA试剂盒可用于检测ASF抗体（Ingenasa，IDvet和Svanovir），其中来自Ingenasa的Ingezim PPA Compac，K3是欧盟层面使用最广泛的（作者个人推荐） 。

目前用于ASF诊断的技术可以在任何流行病学情况下对该病作出可靠的诊断，但是，由于ASF的临床表现形式广泛，而且其症状与其他病毒感染(如猪瘟)的症状相似，因此ASF的诊断较为复杂。

欧盟目前的ASF流行情况使我们有必要审查目前诊断试验方法的敏感性和特异性，以及它们在受影响地区的家养猪和野猪中的诊断ASF的能力。

为此，欧盟非洲猪瘟参考实验室(EURL)与四个受影响的欧盟国家的国家参考实验室（NRL）合作，进行了一项比较研究，该研究使用了目前在欧盟范围内使用的所有ASF诊断测试来分析从家养和田间猪身上采集的实验和田间样本。

本文综述了目前ASF诊断试验方法的性能特点，包括敏感性和特异性，用以指导在受影响国家快速识别和进一步控制ASF的有效行动。

样品

图1 欧盟国家野猪（红色）和家养猪（黄色）采样地点图

（i）来自欧盟内ASFV感染地区的田间猪样品

2014年在欧盟国家（拉脱维亚，立陶宛，波兰和爱沙尼亚）爆发期间收集的314个田间样本用于本研究（图1）。这些样品取自先前由NRL鉴定的总共125只感染动物（91只野猪和34只家养猪）。具体而言，野猪样品包括了182个组织样品，主要来自脾脏（32.2％）和骨髓（21.3％），22个血液，5个血清和2个来自腹膜腔的液体样品（表1） 。家养猪样品包括70个组织，17个血液和16个血清样品（表1）。检测的组织包括28个脾（40％），16个肾（22.9％），11个肺（15.7％），10个淋巴结（14.3％），4个扁桃体（5.7％）和1个膈肌（1.4％）样品。

表1 2014年从欧盟国家疫情中获得的314个检测现场样品的描述

（ii）来自ASFV实验研究的猪样品

实验中，我们定期从三种独立的感染实验中收集150对血清和EDTA样本，这些感染均属于P72基因型II型，具有毒性的ASFV分离株。（表2）此外，从每只剖检动物(肝、脾、扁桃体、心、肺、肾、下颌下、咽后、腹股沟、腘窝、肠系膜、纵隔、胃肝、脾、肾淋巴结)获得15种不同类型的组织和器官。由此，我们得到了用于抗体和ASFV检测的比较研究的总共450个组织样本。动物实验在生物安全三级(BSL3)实验室中进行。

表2 从感染ASFV基因型II病毒的动物收集的实验样品的描述

方法

ASFV检测试验

（i）测试样品

表3 通过ASFV和抗体检测测试的田间和实验样品的数量

表3总结了所选ASFV检测试验并行测试的样品数量和类型。简而言之，通过PCR测定平行测试295个田间采集的样品和从实验感染获得的600个样品。田间样品由252个组织，39个EDTA血液，两个血清和两个体液样品组成，而150个血液和450个组织样品从实验感染中分析。

（ii）通过PCR检测ASFV基因组。

（iii）通过ELISA检测ASFV抗原。

（iv）ASF病毒分离和滴定

ASF抗体检测试验

（i）测试样品

通过选择的ASF抗体检测试验平行测试的样品的数量和类型显示在表3中。总之，综上所述，我们使用ELISAs和IPT检测了150个实验和21个田间血清样本。

通过分析从感染了ASFV基因型ii型的家猪的脾、肝和肺中获得的90份实验渗出液，初步评估了每种检测组织渗出液中ASF抗体的技术性能。

为了确定这些检测的特异性，研究人员从70只未感染ASF的猪身上提取了210个阴性组织分泌物作对照。此外，在欧盟爆发期间采集的140份现场组织渗出物、26份血液和一份液体样本也经过了IPT检测。

（ii）ELISA

（iii）IPT

数据分析

每个测试之间的一致性是使用2乘2列联表计算的两个测定结果之间的总体百分比一致性。

Kappa系数（κ）统计用于评估超出预期的结果之间的一致性水平的显着性：

κ值为0.81-1.00表示几乎完全一致，

k值为0.61-0.80表示基本一致，

k值为0.41-0.60代表良好的一致性，

k值0.21-0.40代表中度一致性，

k值0.01-0.20代表轻度一致性，

k值0.00代表无一致性。

从整体结果分析，分别以IPT和pcr结果作为抗体和病毒检测的参考，计算最终的敏感性和特异性。所有在ELISAs中的结果可疑的样本(在截止时间间隔中给出结果的样本)都被认为是阳性的。

结果

PCRs与抗原ELISA检测ASFV的比较

(i) 感染II型ASFV的实验动物样本

（a）血液样本分析

在30只实验染病猪不同时间采集的150份血液样本中，采用UPL-PCR检测阳性62份(41.3%)，OIE实时PCR检测阳性59份(39.9%)，OIE常规PCR检测阳性52份(34.7%)。

采用抗原ELISA法对样品进行分析，按ELISA试剂盒推荐的阈值48例(32%)检测为阳性。UPL-PCR与OIE 实时 PCR有很好的相关性，在62份UPL-PCR阳性样品中，仅有3份在实时 PCR中检测为阴性。

从暴露于2014年立陶宛强毒ASFV分离株(LT14/1490)的接触动物中采集了三份假阴性血液样本，这些接触动物在整个实验感染过程中都没有表现出任何症状。常规PCR和/或抗原ELISA检测假阴性结果与血液样本相关，实时PCR循环阈值(CT)>30，这些样本主要采集于感染初期。（图2）

图2 利用2014年的ASFV基因型II型立陶宛强毒ASFV分离株(LT14/1490)，从暴露(A)和接种(B)的猪中采集血液样本，采用OIE实时PCR(红色)和UPL实时PCR(蓝色)检测病毒血症的结果。黑色圆圈表示暴露/接种后的当天，OIE常规PCR和Ag-ELISA检测结果为假阴性。

（b）组织样本的分析

用三种PCR方法同时分析了剖检过程中收集的450份组织样本。（表4）

用UPL-PCR在97.8％的测试组织中检测到ASFV基因组，而在OIE规定的PCR检测中，阳性率下降到96.6%。这15个阴性样本来自感染2014年的ASFV基因型II型立陶宛强毒ASFV分离株(LT14/1490)的2头猪身上采集的器官。采用抗原ELISA检测的30例脾脏标本中，28例为阳性，2例为阴性，使我们能够检测出93.3%的感染动物。

表4 比较从实验感染基因型II ASFV分离株的猪采集的血液和组织中的ASFV的UPL-PCR，OIE实时PCR，OIE常规PCR和抗原ELISA的检测结果

（ii）在欧盟疫情爆发期间收集的田间样本

使用UPL-PCR检测到295个测试的田间样品为阳性，阳性率为99.7%。OIE规定的实时PCR和常规的测定阳性率分别降低至98.98％和96.3％（表5）。OIE实时PCR未能鉴定出两个血液样本和一个UPL-PCR阳性的骨髓样本，C T值> 35。使用OIE常规PCR测试，阴性样品的数量增加至10，当用实时PCR测试时，所有C T值均> 30。

表5在欧盟国家流行病爆发期间用于检测来自野猪和家猪的田间采集样本中ASFV基因组的三种PCR检测的比较

通过对92个田间样品（67个脾脏和25个血液样品）的分析评估使用抗原ELISA检测田间感染动物的性能，所有这些样品先前使用UPL-PCR测试为阳性。用抗原ELISA的阳性率是71.74％，来自从79只调查的猪中的65只获得的66个样品（52个脾和14个血液样品）的检测。

（iii）分析结果

采用UPL-PCR检测作为能够检测100％感染或暴露动物的参考方法，使用OIE实时PCR检测，797个ASF阳性样本中检测结果12个假阴性（敏感性为98.5％，[95％CI，97.4%-99.1％]）和OIE常规PCR检测结果26个假阴性（96.7％灵敏度，[95％CI，95.3%-97.8％]）。实验和田间样本的整体分析显示UPL-PCR与OIE规定的实时PCR（κ= 0.94 [95％CI，0.91-0.97]）和常规PCR（κ= 0.88 [95％CI，0.83-0.92]之间几乎完全一致。抗原ELISA达到了77.2％的灵敏度（95％CI，70.6至82.6％），其和UPL-PCR测试之间的良好 - 中度一致性（κ= 0.67 [95％CI，0.58-0.76]）。灵敏度值比较在表6中。

表6 用UPL-PCR作为测试参考，使用OIE规定PCR和商业抗原ELISA（Ingenasa）获得的比较敏感性结果比较

使用猪血清进行抗体检测的ELISA和IPT测定的比较

（i）来自感染基因型II ASFV的实验动物的血清

由于ASFV基因型II分离株诱导的疾病的急性性质，大多数动物在产生可检测的抗体量之前死亡或被屠宰。从接种和暴露动物收集的血清分析显示，IPT在感染天数/暴露天数为16-21之间的可检测抗体反应为23.3％，来自30只家猪中的7只。使用Ingenasa-ELISA将检测水平降低至3只（10％），使用OIE-，IDvet-和Svanova-ELISAs将检测水平降低至2只（6.6％）（表7）。

表7 来自实验感染基因型II ASFV分离株的动物的血清样品IPT和ELISA结果的比较

（ii）来自欧盟受影响地区猪的田间血清样本

2014年从来自受影响的欧盟国家的家猪（16）和野猪（5）收集的21个样本使用四种ELISAs和IPT并行分析。与使用实验血清样品获得的结果一样，由于该疾病的急性性质，IPT检测到的阳性血清数为10个（47.62％），而使用Ingenasa-ELISA检测的阳性血清数减少至6个（37.5％）。使用IDvet-和Svanova-ELISAs为4个（25％），使用OIE规定的ELISA为2个（9.52％）。如EURL（2014）所述，采用终点稀释法（IPT）测定血清中ASFV抗体滴度。结果显示，结果表明，ELISAs检测不出感染猪的抗体效价。Ingenasa-ELISA

beijingrennr

将来没有猪了技术就会出来。